Mỹ đồng thời sẽ đóng cửa hai khu nhà được sử dụng để thu thập thông tin tình báo của Nga ở New York và Maryland.
Lệnh trừng phạt cũng được đưa ra đối với 9 tổ chức và cá nhân, bao gồm các cơ quan tình báo Nga GRU và FSB.
Động thái trên diễn ra sau khi các thượng nghị sĩ cấp cao của Mỹ kêu gọi trừng phạt các quan chức Nga được cho là đóng vai trò trong chiến dịch tấn công mạng nhằm vào cuộc bầu cử tổng thống Mỹ hồi tháng 11.
Các thượng nghị sĩ Cộng hòa John McCain and Lindsey Graham cho biết họ sẽ đi đầu nỗ lực áp đặt các biện pháp cấm vận mạnh tay hơn với Nga trong chính phủ mới của Mỹ.
Trước đó, Tổng thống Obama cũng đã thề sẽ có hành động chống lại Nga giữa những cáo buộc Moscow tấn công mạng đảng Dân chủ và chiến dịch tranh cử của bà Hillary Clinton.
Nga bác bỏ bất kỳ mối liên quan nào tới cáo buộc trên.
Phát ngôn viên điện Kremlin Dmitry Peskov gọi hành động trừng phạt của Mỹ là "một biểu hiện của chính sách đối ngoại hung hăng và không thể lường trước", đồng thời chỉ trích các cáo buộc là "vô căn cứ và không hợp pháp".
Ông tuyên bố rằng Tổng thống Putin sẽ xem xét các biện pháp trả đũa Mỹ.
Đại sứ quán Nga tại Anh viết trên Twitter rằng ông Obama là "một con vịt què".
Tổng thống đắc cử Donald Trump cũng cho rằng cáo buộc Nga can thiệp vào bầu cử Mỹ là "nực cười" và nói rằng người Mỹ "nên tiếp tục cuộc sống của mình" khi được hỏi về khả năng trừng phạt Moscow.